HiFi-MMLV一步法RT-PCR試劑盒說明書
HiFi-MMLV One Step RT-PCR Kit
HiFi-MMLV一步法RT-PCR試劑盒
目錄號：K0745
保存條件：-20℃保存。
組分說明
Cat. No. K0745
Kit Size 100
HiFi-MMLV OneStep RT- PCR EnzymeMix 50 μl
2×OneStep RT-PCR Buffer 1.4 ml
RNase-Free Water 1 ml
本產品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途
產品簡介
本試劑盒是專為一步法RT-PCR實驗研制，逆轉錄和PCR在同一反應體系中進行，
反應過程中無需添加試劑，無需打開管蓋，在避免污染的同時提高了檢測靈敏度和實驗
效率。本試劑盒包括逆轉錄酶、快速熱啟動 DNA聚合酶，同時包含適用于逆轉錄和
PCR擴增的反應緩沖液和實驗中所必需的反應組分。HiFi-MMLV逆轉錄酶RNase H活性
缺失，減少了逆轉錄反應中RNA的降解。HiFi-MMLV逆轉錄酶熱穩(wěn)定性強，可獲得高產
量的cDNA。PCR反應使用的快速熱啟動DNA聚合酶具有擴增效率高、延伸速度快的優(yōu)
良性能。*的緩沖體系使逆轉錄酶和聚合酶同時發(fā)揮大功效。使用本試劑盒擴增得
到的目的產物3′端附有一個″A″堿基，可直接用于T/A克隆。
注意事項
1．在操作過程中應避免RNase污染，防止RNA降解或實驗中的交叉污染，建議在專門
的區(qū)域進行RNA操作，使用專門的儀器和耗材，操作人員帶口罩和一次性手套并經
常更換手套。
2．實驗盡量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，應使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙
酯）水溶液在37℃處理12小時，并在120℃下高壓滅菌30分鐘后使用，或者將玻璃
器皿在180℃下干熱滅菌60分鐘后使用。實驗中用到的無菌水應使用 0.1%的DEPC
處理后進行高壓滅菌。
3．本試劑盒中的所有試劑使用前請上下顛倒輕輕混勻，盡量避免起泡，并經短暫離心
后使用。所涉及的酶類使用后應盡快放回-20℃，避免反復凍融。
4．本試劑盒必須使用特異性引物，引物的選擇可根據具體實驗來選擇，引物設計的好
壞直接影響到RT-PCR 反應的結果，設計引物時需考慮GC含量，引物長度，引物
位置，PCR產物的二級結構等因素，建議采用專業(yè)的引物設計軟件來設計。
使用方法
1．將RNA模板、引物、 OneStep RT-PCR Buffer、OneStep RT-PCR EnzymeMix
和RNase-Free Water溶解并置于冰上備用。
2．根據以下表格配制反應體系：
試劑 25 μl反應體系 終濃度
2×One Step RT-PCR Buffer 12.5 μl 1×
Forward Primer，10 µM 1 μl 0.4 μM
Reverse Primer，10 µM 1 μl 0.4 μM
HiFi-MMLV OneStep RT-PCR EnzymeMix 0.5 μl
RNA Template X μl 10 pg –1 µg
RNase-Free water up to 25 μl
注意：引物濃度請以終濃度0.1-1.0 μM作為設定范圍的參考。擴增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應時，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應體系。
3．渦旋震蕩混勻，短暫離心，將溶液收集到管底。
4．將熱循環(huán)儀預熱到45℃，將PCR管置于熱循環(huán)儀中，進行RT-PCR反應。
反應條件：
步驟 溫度 時間
反轉錄 45℃ 30 min
PCR預變性 95℃ 2 min
變性 94℃ 30 s
退火 55-65℃ 30 s 30-40個循環(huán)
延伸 72℃ 30 s
終延伸 72℃ 5 min
注意：1）一般PCR實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度Tm低5℃，退火時間一般為20-30秒，無法得到理想的擴增效率時，適當降低退火溫度；發(fā)生非特異性反應時，提高退火溫度，由此優(yōu)化反應條件。
2）延伸時間根據擴增的片段大小設定，本產品中包含的DNA Polymerase擴增效率為1 kb/30s。
3）可根據擴增產物的下游應用設定循環(huán)數。循環(huán)次數太少，擴增量不足；循環(huán)次數多，錯配機率會增加，非特異性背景嚴重。所以，在保證產物得率的前提下，應盡量減少循環(huán)次數。
5．反應結束后取5 µl反應產物，加入適量上樣緩沖液后進行電泳檢測結果。
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