TB基因分型試劑盒 VNTR-9
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k2571
TB 基因分型試劑盒 HV-3
產品簡介
本試劑盒是以分子流行病學新一代研究進展
1）
為基礎，經工藝優(yōu)化后形成的人型結核分枝桿菌基因分型產品。本產品利用
結核分枝桿菌基因組中可變數(shù)目串聯(lián)重復序列（variable-number tandem repeats, VNTR）多態(tài)性進行基因型分型區(qū)分臨
床菌株，是研究結核分枝桿菌分子流行病學和監(jiān)測結核病傳播狀況的有力工具。與現(xiàn)有其它基于VNTR原理的結核分枝桿菌
VNTR分型系統(tǒng)相比，這一分型系統(tǒng)對中國流行的菌株具有更強的分辨能力1，2，3），因此特別適合于中國用戶的需求。
通過對各PCR反應引物序列和預混反應液成份進行精心優(yōu)化，使得本產品具有很強的抗干擾力。與用戶自配試劑相比，
本產品顯著提升了特異條帶信號強度，降低了使用粗制模板（煮沸菌液）時非特異條帶的出現(xiàn)率，使實驗操作更加簡便、快
捷的同時，提高了檢測成功率。本產品的預混反應液化學穩(wěn)定性良好，能有效抵抗反復凍融（10次）和較長時間（一周）
的室溫環(huán)境，更好地適應了用戶檢測工作中的靈活性需求。
本產品將人型結核分枝桿菌（MTBC）鑒定、非結核分枝桿菌（MOTT）及模板質量鑒定、結核分枝桿菌北京家族菌株
鑒定，和后續(xù)的9位點VNTR分型鑒定整合在一個試劑盒中，使用戶僅需一個試劑盒、12個PCR反應即可獲得待測菌株基因
型鑒定所需的完整信息。檢測的分辨力指數(shù)（Hunter-Gaston index，HGI）可達0.989 。并且，基因型鑒定結果可數(shù)字
化記錄，使得不同樣本批次，不同地區(qū)，不同時間，不同研究者之間的實驗數(shù)據(jù)可以很方便地進行比對和匯集分析，
提高了數(shù)據(jù)的使用效率。
對鑒定為VNTR-9基因型成簇（所有9個位點具有相同重復數(shù)）的樣本，若要判定菌株間是否存在近期傳播關系，需使用
配套產品TB基因分型試劑盒HV-3（貨號K2571），做進一步的分型鑒定。VNTR-9與HV-3兩個產品的結合使用可將檢測
的HGI提升至0.993 。關于TB基因分型試劑盒HV-3（貨號K2571）產品的更多信息請見其產品說明書。
1）
參考文獻
1） Luo T et al. Development of a hierarchical variable-number tandem repeat typing scheme for Mycobacterium
tuberculosis in China. PLoS One. 2014 Feb 25;9(2)
2） Sun G et al. Discriminatory potential of a novel set of Variable Number of Tandem Repeats for genotyping
Mycobacterium marinum. Vet Microbiol. 2011 Aug 26;152(1-2)
3） Zhang L et al. Highly polymorphic variable-number tandem repeats loci for differentiating Beijing genotype
strains of Mycobacterium tuberculosis in Shanghai, China. FEMS Microbiol Lett. 2008 May;282(1):22-31.
注意事項
1.為避免污染，建議制備樣本和配制 PCR Mix 在不同的地點內進行，并使用不同的移液器。
2.在樣本 DNA 的收集，抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應注意作好標記，同時防止不同樣本間發(fā)生交叉污染。
3.常用試劑和耗材在實驗前需高壓滅菌。
4.每管 PCR Mix 中均含有不同的引物，不可混用?？筛鶕?jù)實驗需求一次性分裝為不同的量，避免反復凍融。
5.為避免打開反應管時，反應液飛濺，開蓋前請短暫離心，收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手
套并用 75%酒精或稀酸擦拭桌面。
6.吸取時注意不要交叉污染 PCR Mix，建議每次取 Mix 前用 75%酒精擦拭移液器頭 2 次。
7.
實驗前準備：1×TE 緩沖液（PH=8.0）、0.5×TBE 緩沖液、瓊脂糖、溴化乙錠（EB）、普通 PCR 儀、DNA 電泳設備和
凝膠成像儀、0.2 ml PCR 反應管、八聯(lián)排或 96 孔 PCR 管、不同規(guī)格的移液器：0.5-10 μl 和 20-200 μl。
操作步驟
1.
DNA 模板制備：
1.1 從固體培養(yǎng)基上刮取少量（1-2 接種環(huán)）樣本，重懸于 100 μl TE 中，80°C 滅活 30 分鐘。
1.2 滅活后的菌株拿出 P3 實驗室進行如下操作：
100°C 煮沸 10 分鐘（煮沸時 EP 管蓋子可能會爆開，要盡量避免，扣緊 EP 管，不要讓水進入管中），立即置于冰上 2
分鐘，12,000 rpm（~13,400×g）離心 10 分鐘后，取上清置于另一無菌 EP 管中，做上標記，-20°C 保存。
2.
檢測程序：
2.1 取出 TB 基因分型試劑盒 VNTR-9，待液體平衡到室溫后，輕微搖晃 3-4 次混勻，12,000 rpm 離心 5 秒，使蓋上的
液體收集到管內。
2.2 結核分枝桿菌基因型分析：
2.2.1 鑒定樣本是否為人型結核分枝桿菌（重要！此步驟不可省略?。?/span>
A．PCR 擴增：反應體系為 20 μl。
在每個 PCR 管中分別加入 19 μl Mtb 鑒定 PCR Mix，1 μl DNA 模板，混勻。
B．反應程序：
C.
制膠，電泳
使用 1%的瓊脂糖凝膠對 PCR 擴增產物進行電泳。
配制 1%的瓊脂糖凝膠，12×6 cm 膠盤制膠，每塊膠為 40 ml。
1）稱取 0.4 g 瓊脂糖，加入 40 ml 0.5×TBE，在天平上稱重后放入微波爐，高火加熱 2-3 分鐘，使瓊脂糖*溶化，搖
勻，觀察為均一透明溶液，無顆粒，再在天平稱量，補入適量的雙蒸水，以保持膠凝膠的濃度不受影響。
2）待融化的凝膠冷卻至 55℃左右時加入 2 μl 溴化乙錠（10 ug/ml），輕輕旋轉以充分混勻。用 18 齒的梳子制膠，將
溫熱的凝膠澆灌入膠盤。
3）待凝膠*凝結（室溫下放置 30 分鐘），小心拔出梳子，取出托盤，放入電泳槽中。電泳槽中加入 0.5×TBE 緩沖液，
沒過膠面 1-2 mm。
4）PCR 產物上樣：每個孔中加入 3 μl PCR 產物，每塊膠上留一個孔加入 5 μl MarkerⅠ，每塊膠上加一個 H37Rv 作
為質量控制。電壓 150V，電泳時間為 45 分鐘。
結果顯示：
D．結果分析：
1）如果出現(xiàn)了 850 和 361 bp 兩條帶，則說明模板 DNA 是人型結核分枝桿菌，可進入第 F 步（見后面）進行結核分枝桿
菌北京基因型的分析鑒定，并進一步使用本試劑盒對該菌株進行 9 位點 VNTR 基因型分析鑒定。
2）如果只擴增出 850 bp 的條帶，則說明該菌株屬于結核分枝桿菌復合群，但不是人型結核分枝桿菌，不適用本產品進行
基因型分析鑒定。
4）如果沒有特異性條帶擴增，則說明該菌株是非結核分枝桿菌或模板 DNA 質量不好，不適用本產品進行基因型分析鑒定，
可放棄該樣本，或進入第 E 步（見后面），檢測 DNA 模板的質量。
E．DNA 模板質量鑒定：
若在以上步驟 A-D 中沒有特異性條帶擴增，則說明模板 DNA 質量不佳或該菌株并非結核分枝桿菌，出現(xiàn)此種情況請
進行如下操作。
1）PCR 擴增：反應體系為 20 μl。
在每個 PCR 管中分別加入 19 μl 16S rRNA PCR Mix，1 μl DNA 模板，混勻。
2）反應程序：
3）電泳
1%瓊脂糖凝膠電泳，150V 電泳 45 分鐘；
4）結果顯示：
5）結果分析：
所有細菌中都存在 16S rRNA 序列，如果樣本無擴增產物，說明模板 DNA 的數(shù)量或質量不足以進行 VNTR 基因分型
檢測。如果有擴增產物條帶出現(xiàn)，則說明此菌株為非結核分枝桿菌，不應使用本試劑盒進行基因分型鑒定。
F．北京基因型菌株鑒定方法：
在確定菌株為結核分枝桿菌后，進一步區(qū)分是否屬于北京基因型菌株。
1）PCR 擴增：反應體系為 20 μl。
在每個 PCR 管中分別加入 19 μl RD105 PCR Mix，1 μl DNA 模板，混勻。
2）反應程序：
3）電泳
1%瓊脂糖凝膠電泳，150V 電泳 45 分鐘。
4）結果顯示：
5）結果分析：
如果擴增產物為 1495 bp，該菌株為非北京基因型菌株；
如果擴增產物為 786 bp，該菌株為北京基因型菌株。
2.2.2 結核分枝桿菌 9 位點 VNTR 基因型分型法：對結核分枝桿菌臨床菌株進行基因型分析，初步鑒定成簇菌株。
A．PCR 擴增：反應體系為 20 μl。
取 9 個 PCR 反應管，在每個 PCR 管中分別加入 19 μl QUB-11b，QUB-18，QUB-26，MIRU26，MIRU31，MIRU40，
Mtub21，Mtub04，VNTR2372 的 PCR Mix，加入 1 μl DNA 模板，混勻。
B . 反應程序：
C. 制膠、電泳：
C-1：注意事項：
重要！每次實驗需要設置陽性（H37Rv 菌株 DNA）和陰性對照（去離子水）。
關鍵！本實驗是以瓊脂糖凝膠電泳為基礎來判讀 VNTR 位點基因型，因此，為了使不同實驗室結果能準確的相互比較，
在電泳這一步必須要按照統(tǒng)一的標準操作，應注意以下幾點：
1） 制膠所用梳子為 18 孔。
2） 凝膠左右邊上的兩個孔由于在電泳過程中容易使條帶變形，影響結果判讀，舍棄不用，或者在其中一個孔點上陰性對
照，剩余 16 孔分為 12 個樣本，3 個 DNA Marker 和 1 個陽性對照。點樣順序分別為“1，2，M，3，4，5，6，M，
7，8，9，10，M，11，12，H37Rv”，數(shù)字代表樣本，M 代表 DNA Marker。
3） PCR 擴增產物進行首ci電泳并使用 Marker I 時，凝膠濃度為 1%，應使用兩電極間距離不小于 30 厘米的電泳槽，電
壓為 150V，時間為 100-120 分鐘。
4） 如果擴增產物片段過大（>1000bp），需要再次電泳并使用 Marker II 時，凝膠濃度為 0.8%，應使用兩電極間距離不
小于 30 厘米的電泳槽，電壓 150V，時間為 150 分鐘。
C-2：制膠以及電泳過程：
使用 1%的瓊脂糖凝膠對 PCR 擴增產物進行電泳。
配制 1%的瓊脂糖凝膠，12×12 cm 膠盤制膠，每塊膠為 80 ml。
1）稱取 0.8 g 瓊脂糖，加入 80 ml 0.5×TBE，在天平上稱重后放入微波爐，高火加熱 2-3 分鐘，使瓊脂糖*溶化，搖勻，
觀察為均一透明溶液，無顆粒，再在天平稱量，補入適量的雙蒸水，以保持膠的濃度不受影響。
2）待融化的凝膠冷卻至 55℃左右時加入 4 μl 溴化乙錠（10 ug/ml），輕輕旋轉以充分混勻。用 18 齒的梳子制膠，將溫
熱的凝膠澆灌入 12×12 cm 膠盤。
3）待凝膠*凝結（室溫下放置 40 分鐘），小心拔出梳子，取出托盤，放入電泳槽中。電泳槽中加入 0.5×TBE 緩沖液，
沒過膠面 1-2 mm。
4）上樣電泳：每塊膠中加入 12 個樣本（最邊上的孔不加樣），每個孔中加入 3-5 μl PCR 產物，同時每塊膠上加三個 5 μl
DNA MarkerⅠ，加一個 H37Rv 作為質量控制（點樣孔分布見下圖）。電壓 150V，電泳時間為 100-120 分鐘。本步驟
是各位點最終讀數(shù)是否準確的關鍵，需要統(tǒng)一按照此標準操作。
5）部分位點（QUB-18 及 QUB-26）在臨床菌株中存在擴增產物大于 1000 bp 的情況，對這些擴增產物再利用 0.8%瓊脂
糖凝膠進行電泳，同時加入 DNA MarkerⅡ 作為條帶大小對照，電壓 150V，電泳時間 150 分鐘。
MarkerⅠ
MarkerⅡ
D. 結果分析：
根據(jù)各臨床菌株擴增條帶與 Marker 相對位置，利用凝膠分析軟件讀出每個條帶的大小。利用各 VNTR 位點重復單元讀
數(shù)表及 VNTR 位點讀數(shù)規(guī)則，計算出各菌株在該位點的重復單元數(shù)，每個 VNTR 位點重復單元讀書表及 VNTR 位點讀數(shù)規(guī)
則附后。
結果報告： Excel 文件（以下表格為結果報告輸出格式舉例）
比較不同菌株 9 個 VNTR 位點的重復數(shù)，進行成簇分析：如果兩個或兩個以上菌株具有相同 9 位點基因型，則初步鑒
定為成簇菌株，如有必要，可使用配套產品，K2571， TB 基因分型試劑盒 HV-3，做更精細的進一步分型鑒定。如果
分離的菌株具有特異的 9 位點基因型，則鑒定為單一菌株。
附錄 1：VNTR 位點讀數(shù)規(guī)則
附錄 2 ：VNTR 位點重復單元讀數(shù)表
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