丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量試劑盒說明書 |
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丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量試劑盒說明書 可見分光光度法 正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定 測(cè)定意義: 氧自由基作用于脂質(zhì)的不飽和脂肪酸,生成過氧化脂質(zhì);后者逐漸分解為一系列復(fù)雜的化合物,其中包括 MDA。通過檢測(cè) MDA 的水平即可檢測(cè)脂質(zhì)氧化的水平。 測(cè)定原理: MDA 與硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)縮合,生成紅色產(chǎn)物,在 532nm有大吸收峰,進(jìn)行比色后可估測(cè)樣品中過氧化脂質(zhì)的含量;同時(shí)測(cè)定 600nm 下的吸光度,利用 532nm與 600nm 下的吸光度的差值計(jì)算 MDA 的含量。 需自備的儀器和用品: 可見分光光度、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。 試劑的組成和配置: 提取液:液體 60mL×1 瓶,4℃保存; 試劑一:液體 30mL×1 瓶,4℃保存; 注意事項(xiàng): 臨用前注意試劑一是否*溶解,如未溶解,可以 70℃加熱,并振蕩以促進(jìn)溶解。 MDA 提?。?/span> 1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備: 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。 組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織, 加入 1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。 2、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。 測(cè)定步驟: 1、吸取 0.6mL試劑一于1.5mL 離心管中,再加入0.2mL 樣本, 混勻。 2、95℃水浴中保溫 30min(蓋緊,防止水分散失),置于冰浴中冷卻,10000g,25℃,離心 10min。 3、吸取上清液于1mL玻璃比色皿中,測(cè)定532nm和600nm處的吸光度,記為A532 和A600, ΔA= A532-A600。(蒸餾水調(diào)零)
MDA 含量計(jì)算: 1、血清(漿)中 MDA 含量的計(jì)算: MDA 含量(nmol/mL)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷V 樣=25.8×ΔA 2、細(xì)菌、細(xì)胞或動(dòng)物組織中 MDA 含量計(jì)算 (1)按照蛋白濃度計(jì)算 MDA 含量(nmol/mg prot)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V樣)=25.8×ΔA ÷Cpr 需要另外測(cè)定,建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。 (2)按照樣品質(zhì)量計(jì)算 MDA 含量(nmol/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) =25.8×ΔA ÷W (3) 按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算: MDA 含量(nmol/104 )=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) =0.0516×ΔA V 反總:反應(yīng)體系總體積,8×10-4 L;ε:丙二醛摩爾消光系數(shù),155×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V 樣:加入樣本體積,0.2 mL;V 樣總:加入提取液體積,1 mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬。
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