更新時(shí)間: | 2023-06-29 |
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廠商性質(zhì): | 生產(chǎn)廠家 |
本品用于分離狗外周血NK細(xì)胞 Store at: RT° C Size :3X100ml試劑盒內(nèi)容試劑:全血及組織稀釋液 100ml試劑:細(xì)胞洗滌液 100ml試劑B: 100ml試劑D: 100ml試劑E: 100ml說(shuō)明書(shū) 1份
狗外周血NK細(xì)胞分離液試劑盒
Store at:::RT 試劑盒規(guī)格::::3×100ml/Kit
試劑盒內(nèi)容:
全血及組織稀釋液 100ml
細(xì)胞洗滌液 100ml
試劑 B 100ml
試劑 D 100ml
試劑 E 100ml
說(shuō)明書(shū) 1 份
狗外周血NK分離液試劑盒
1. 適用于各種動(dòng)物血液及臟器組織本系列產(chǎn)品檢索
2. 相關(guān)試劑及耗材
3. 注意事項(xiàng)
4. 應(yīng)用
5. 產(chǎn)品性能指標(biāo)
6. 貯藏及保存期限
7. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
8. NK 細(xì)胞分離液試劑盒使用方法說(shuō)明及圖例
9. HES-TBD550 使用說(shuō)明
10. 組織單細(xì)胞懸液的制備
11. 生產(chǎn)企業(yè)
12. 參考文獻(xiàn)
2. .. 注意事項(xiàng) A. 本分離液是敏光型的,在運(yùn)輸和貯藏過(guò)程中應(yīng)在 18℃-25℃避光保存,啟封后置 4℃保存避免微生物污染。另外,本品為真空包裝,未啟封前置于 10℃ 以下易出現(xiàn)白色結(jié)晶,影響分離效果。
B. 待分離的血液、組織及細(xì)胞要求新鮮,避免冷凍和冷藏。分離液和所分離樣本一
定在20℃水浴箱中復(fù)溫20分鐘保證分離液和所分離樣本溫度在20℃±2℃時(shí)分離效果,
且所有操作過(guò)程一定要在無(wú)菌條件下進(jìn)行。
C. 由于各品牌離心機(jī)的性能不同,國(guó)內(nèi)南北地區(qū)溫度環(huán)境和四季的差異,可能影響
分離效果,用戶可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù),調(diào)節(jié)離心的時(shí)間,摸索*的分離條件(具體分離條件
各實(shí)驗(yàn)室自定)。
D. 使用無(wú)靜電反應(yīng)的離心管,推薦使用未經(jīng)過(guò)堿處理的玻璃離心管。
E. *抗凝劑選擇:EDTA、枸櫞酸、肝素。應(yīng)注意在血液稀釋過(guò)程中應(yīng)去除抗凝劑
體積。
F. 分離過(guò)程中所用其他試劑如:羥乙已基淀粉 550、全血及組織稀釋液、細(xì)胞洗滌液及
紅細(xì)胞裂解液等以我公司產(chǎn)品為*選擇,本公司相關(guān)系列產(chǎn)品無(wú)菌、無(wú)病毒、無(wú)支原體、
低內(nèi)毒素水平且無(wú)細(xì)胞毒性,所獲得的細(xì)胞可保持完好的生物活性和完整的細(xì)胞形態(tài)。
4. .. 應(yīng) 4. 用
適用于從人或各種動(dòng)物血液或臟器組織中分離 NK 細(xì)胞。
5.. . . 產(chǎn)品性能指標(biāo)
pH 7.0-7.5
滲透壓 280-340mOsmol/kg
內(nèi)毒素 ≤0.5...EU/ml
無(wú)菌 直接接種培養(yǎng) 14 天后培養(yǎng)基澄清
澄明度及不溶性顆粒物 每 50ml 溶液中含 10μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 20 粒以下含 25μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 5 粒以下
6.. . . 貯藏及保存期限 貯藏及保存期限
18℃-25℃避光保存,有效期兩年。啟封后置 4℃保存,有效期一周。
注::::若保證無(wú)微生物污染,啟封后可置 4℃長(zhǎng)期保存。但應(yīng)注意保存溫度較低時(shí)本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶,影響分離效果。
7. .. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 7. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
A. 試劑
NK 細(xì)胞分離液試劑盒所含試劑、組織勻漿液、胎牛血清
B. 器材 玻璃離心管、玻璃滴管 水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)、無(wú)菌工作臺(tái)
A. 在 10ml 或 15ml 玻璃離心管中依次小心加入 B、D 兩種液體各 2ml,制成梯度界面(各液面分層一定要清晰);
B.取 1ml新鮮抗凝血或組織單細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度為2×108
-1×109個(gè)/ml,具體制備方法參照“10.組織單細(xì)胞懸液的制備”)與試劑E 1:1混合后再按2:1的比例與全血及組織稀釋液(Cat#:2010C1119)混勻。20℃-30℃靜置20-30分鐘,吸取上層渾濁液備用,棄去大部分紅細(xì)胞;
C.將步驟B中吸取的上層渾濁液小心加于D液之液面上;
D. 以400g(約1500轉(zhuǎn)/分)離心15分鐘(半徑15cm水平轉(zhuǎn)子);
此時(shí)離心管中由上至下細(xì)胞分為四層。*層;為上清液層(包含血小板和血漿)。第
二層;;;;為 NK 細(xì)胞層。。。。第三層;為渾濁分離液層(含大量 T、B 及粒細(xì)胞)。第四層;為極少量紅細(xì)胞層。收集第二層 NK 細(xì)胞放入含 4-5ml 細(xì)胞洗滌液(Cat#:2010X1118)的試管中,充分混勻后,以 500g(約 1800 轉(zhuǎn)/分)離心 20 分鐘,棄去上清留沉淀細(xì)胞重新懸起。重復(fù)洗滌 2 次即得所需 NK 細(xì)胞。
注::::A. 提取率約為 80%。
B.分離大量樣品時(shí),具體操作方法請(qǐng)參照我公司“淋巴細(xì)胞快速分離技巧”,查詢路徑:
HES 是從支鏈淀粉衍生出來(lái)的,是富含淀粉的復(fù)合物,其生理和化學(xué)特性主要由羥乙已基
取代度即取代級(jí)、平均分子量決定。大量實(shí)驗(yàn)表明平均分子量越大對(duì)紅細(xì)胞的凝集作用越強(qiáng),
有效提高紅細(xì)胞的沉降速度,從而使紅細(xì)胞與其它細(xì)胞分離。故而,使用 HES-TBD550(羥
乙基淀粉 550)沉淀法是一種高效的細(xì)胞分離方法。
間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells ,MSCs) 是指一群可向成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞、
骨髓基質(zhì)細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞分化的多潛能組織干細(xì)胞,是在
細(xì)胞治療、基因治療中有效發(fā)揮作用的理想工程細(xì)胞。MSCs 不僅存在于骨髓,也可從臍血、
外周血中以及脂肪組織、肌肉、胎兒器官、大腦、牙齒中分離。UCB - MSCs 的分離、篩選、
增殖、分化與臍血樣本的選擇、培養(yǎng)基的差異以及分離、擴(kuò)增分化過(guò)程中操作技術(shù)等多種因
素有關(guān)。目前用于 UCB - MSCs 分離的方法有:貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀
法和免疫磁珠法。流式細(xì)胞儀法對(duì)細(xì)胞損傷較大,免疫磁珠法價(jià)格相對(duì)較貴且由于抗原抗體
反應(yīng)也容易改變細(xì)胞原有特性,而 HES-TBD550(羥乙已基淀粉 550)聯(lián)合密度梯度離心法常與貼壁篩選法結(jié)合使用,可提高所得 UCB - MSCs 的純度,目前研究多采用此法。國(guó)內(nèi)不少學(xué)者采用羥乙已基淀粉沉淀紅細(xì)胞,然后再進(jìn)行離心分離單個(gè)核細(xì)胞,也取得不錯(cuò)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)證明采用隨機(jī)數(shù)字表法,將每份臍血隨機(jī)分入兩個(gè)不同處理組,從而將臍血樣本的個(gè)體差異減小到zui小程度。結(jié)果證實(shí),HES-TBD550(羥乙已基淀粉 550)聯(lián)合密度梯度離心法獲得的有核細(xì)胞數(shù)量明顯多于 FICOLL 密度梯度離心法。本實(shí)驗(yàn)采用的羥乙已基淀粉商品名為
HES-TBD550(羥乙已已基淀粉 550),克分子滲透壓為 308mosm/L,膠體滲透壓為 68/36 mmHg,可影響紅細(xì)胞集聚性沉降率。紅細(xì)胞集聚是可遞性橋接結(jié)構(gòu)形成的結(jié)果,由大的 HES-TBD550(羥乙已基淀粉 550)分子處在紅細(xì)胞之間聯(lián)接而成。HES-TBD550(羥乙已基淀粉 550)同時(shí)還阻礙白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附,并使平均血小板容積呈現(xiàn)微弱地降低,從而有輕度抑制血小板集聚的功能。臍血經(jīng) HES-TBD550(羥乙一基淀粉 550)處理后,可使紅細(xì)胞沉積至試管底,對(duì)其它主要成分包括干細(xì)胞無(wú)影響。經(jīng)這樣處理后,實(shí)驗(yàn)時(shí)間相對(duì)較短(平均為 1.5 h),步驟相對(duì)較少,細(xì)胞污染幾率小,從而使細(xì)胞數(shù)損失減少。結(jié)論證明,與相應(yīng)的干細(xì)胞分離液聯(lián)合分離使用羥乙已基淀粉沉淀法是一種高效的臍血干細(xì)胞分離方法。
10.. . . 組織單細(xì)胞懸液的制備
注::::A.. .. 本說(shuō)明只提供機(jī)械勻漿制備單細(xì)胞懸液的方法 本說(shuō)明只提供機(jī)械勻漿制備單細(xì)胞懸液的方法 本說(shuō)明只提供機(jī)械勻漿制備單細(xì)胞懸液的方法,,,,酶消化法由于各實(shí)驗(yàn)室選取的消化 酶消化法由于各實(shí)驗(yàn)室選取的消化
酶種類(lèi)各不相同,,,,請(qǐng)各實(shí)驗(yàn)室自行選擇進(jìn)行試驗(yàn) 請(qǐng)各實(shí)驗(yàn)室自行選擇進(jìn)行試驗(yàn) 請(qǐng)各實(shí)驗(yàn)室自行選擇進(jìn)行試驗(yàn)。。。。
B. .. 全過(guò)程及所需試劑要求無(wú)菌環(huán)境 B. 全過(guò)程及所需試劑要求無(wú)菌環(huán)境 全過(guò)程及所需試劑要求無(wú)菌環(huán)境。。。。
剪碎法::::將組織塊放入平皿后,加入少量組織勻漿液及 20%胎牛血清;用眼科剪將組織剪至
勻漿狀,加入 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清;用吸管吸取組織勻漿,用 100 目不銹鋼濾網(wǎng)
(另購(gòu))過(guò)濾到試管內(nèi);離心沉淀 1500轉(zhuǎn)/分×3 min,再用細(xì)胞洗滌液清洗 3次,每次以 500rpm
短時(shí)低速離心除去細(xì)胞碎片,以 200 目不銹鋼濾網(wǎng)(另購(gòu))過(guò)濾去細(xì)胞團(tuán)塊。作細(xì)胞計(jì)數(shù)并
調(diào)整細(xì)胞濃度為(2~5)×107個(gè)/ml。常溫下放置, 待測(cè)細(xì)胞的活力。分離前用 20%胎牛血
清或全血及組織稀釋液懸起細(xì)胞濃度為 2×108
-1×109個(gè)/ml 的單細(xì)胞懸液備用。
勻漿器法:用眼科剪將組織剪成小塊;放入 70ml 組織研磨器內(nèi),加入 2ml 組織勻漿液及 20% 勻漿器法
胎牛血清;緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)研棒,研磨至勻漿;用 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清沖洗研器;收集
細(xì)胞懸液,經(jīng) 200 目不銹鋼濾網(wǎng)(另購(gòu))過(guò)濾;離心沉淀 800rpm×2min ,再用細(xì)胞洗滌液
洗 3 次,離心沉淀。作細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為(2~5)×107個(gè)/ml。常溫下放置, 待測(cè)
細(xì)胞的活力。分離前用 20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細(xì)胞濃度為 2×108
-1×109 個(gè)
/ml 的單細(xì)胞懸液備用。
細(xì)胞計(jì)數(shù)法是用來(lái)計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中細(xì)胞數(shù)量的一種方法。一般利用計(jì)數(shù)板(血球計(jì)數(shù)板)
進(jìn)行。既可用于分離(散)細(xì)胞培養(yǎng)接種前計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量,也可用于
對(duì)培養(yǎng)物的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。不論計(jì)數(shù)的對(duì)象如何,均須制備分散的細(xì)胞懸液。
計(jì)數(shù)與計(jì)算過(guò)程
1)、在細(xì)胞計(jì)數(shù)板中央放置計(jì)數(shù)的蓋玻片。
2)、用玻璃虹吸管吸取細(xì)胞,讓虹吸管在蓋玻片上或下側(cè)的計(jì)數(shù)板凹蹧處流出懸液,至
蓋玻片被液體充滿為止。
3)、置顯微鏡下計(jì)數(shù)四角大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。對(duì)于壓線的細(xì)胞只計(jì)數(shù)在上線和左線者,
對(duì)于細(xì)胞團(tuán)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)。
4)、按下式計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液的密度:
細(xì)胞密度=(4 個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4)×104個(gè)/ml×稀釋倍數(shù)
公式中乘以 104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為:
1.0mm(長(zhǎng))×1.0mm(寬)×0.1mm(高)=0.1mm3
而 1ml=1000mm3
細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn): 細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn):::
A. 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí),要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于 104個(gè)/ml,如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離
心再懸浮于少量培養(yǎng)液中;顯微鏡下計(jì)數(shù)時(shí),遇到 2 個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán),應(yīng)按單個(gè)細(xì)
胞計(jì)算。如果細(xì)胞團(tuán)>10%,說(shuō)明細(xì)胞分散不充分; 或細(xì)胞數(shù)<200 個(gè)/10mm2或>500 個(gè)/10 mm2
時(shí),說(shuō)明稀釋不當(dāng),需重新制備細(xì)胞懸液。
B. 要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好,否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。
C. 取樣計(jì)數(shù)前,應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液,尤其是多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更要注意每次取樣都要混
勻,以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確;
D. 數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞,若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí),只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)
胞壓在格線上時(shí),則只計(jì)上線,不計(jì)下線,只計(jì)左線,不計(jì)右線。
E. 操作時(shí),注意蓋玻片下不能有氣泡,也不能讓?xiě)乙毫魅肱赃叢壑?,否則要重新計(jì)數(shù)。
初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤: 初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤:::
A. 計(jì)數(shù)前未將待測(cè)懸液吹打均勻。
B. 滴入細(xì)胞懸液時(shí)蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。
C. 滴入懸液時(shí)的量太多,至使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。
貨號(hào) 品牌 產(chǎn)品名稱 規(guī)格 報(bào)價(jià)
WBC1085 | TBD | 豚鼠外周血白細(xì)胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1085P | TBD | 豚鼠臟器組織白細(xì)胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1085Z | TBD | 豚鼠腫瘤浸潤(rùn)組織白細(xì)胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1090C | TBD | 雞外周血白細(xì)胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1090CP | TBD | 雞臟器組織白細(xì)胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1078H | TBD | 猴外周血白細(xì)胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1078HP | TBD | 猴臟器組織白細(xì)胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1078HZ | TBD | 猴腫瘤浸潤(rùn)組織白細(xì)胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1110 | TBD | 豬外周血白細(xì)胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1110P | TBD | 豬臟器組織白細(xì)胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1110C | TBD | 豬腸黏膜組織白細(xì)胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1110Z | TBD | 豬腫瘤浸潤(rùn)組織白細(xì)胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1094 | TBD | 馬外周血白細(xì)胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1094P | TBD | 馬臟器組織白細(xì)胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1094Z | TBD | 馬腫瘤浸潤(rùn)組織白細(xì)胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1087 | TBD | 羊外周血白細(xì)胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1087P | TBD | 羊臟器組織白細(xì)胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |